20 квітня 2016

Кохана, ми вбиваємо мишей: чому вчені проводять досліди на тваринах і як це всіх нас рятує

У свіжому номері українського науково-популярного журналу «Куншт» вийшов матеріал про те, як вчені використовують мишей для дослідів, чому це важливо для кожного з нас і як взагалі наука до цього прийшла. Автор тексту – кандидат біологічних наук, співробітник Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, старший викладач факультету біомедичної інженерії КПІ Оксана Півень. Редакція «Куншту» люб’язно надала нам цей матеріал для публікації.

 

 

 

Так, іноді піддослідні мишки вмирають заради науки. Та існує ряд пояснень, чому вони – кращий варіант серед генно модифікованих тварин і яких етичних правил дотримуються вчені при використанні pocket-size humans.

 

Якщо говорити мовою термінів, то трансгенними називають організми, генотип яких був цілеспрямовано змінений шляхом введення чужорідної ДНК. Саме ця введена чужорідна ДНК і називається трансгеном, а сам процес – трансгенезом, або трансгенною технологією. Модифікованими можуть бути як рослини і бактерії, так і тварини. А почалось все це у далекому 1972 році, коли американський учений Пол Берг зі Стенфордського університету вперше об'єднав у пробірці два гени, виділені з різних організмів – ген бактерії і онкогенний вірус мавп. Пол Берг отримав рекомбінацію ДНК (пояснення деяких термінів див. в кінці матеріалу. – Platfor.ma), яка нізащо і ніколи не могла б утворитися в природі. Ця ДНК була внесена в бактеріальні клітини, і так було створено перший трансгенний організм. На бактеріях вчені не зупинились, і дослідження продовжилися на мишах, рибках, кроликах…

 

Утім, не варто думати, що вчені просто хочуть погратись у бога. Отримані таким чином організми широко використовують як в суто наукових роботах, так і для виробництва ліків, при створенні методів генної терапії хвороб людини, а також у сільському господарстві. Вже створено низку різних бактерій, що, наче біореактори, виробляють цінні білки для людських потреб. Це й інсулін для діабетиків, і фактор згортання крові для лікування гемофілії. Головна перевага такої технології полягає в тому, що після трансгенезу бактерії виробляють саме людський білок, який легко напрацювати у великій кількості та який не буде викликати алергію, як, наприклад, інсулін свиней у деяких діабетиків. У якості таких біореакторів використовують не лише бактерії, а й багатоклітинні трансгенні організми.

 

Трансгенні тварини у лабораторіях

 

За допомогою ГМО вивчаються процеси та закономірності розвитку деяких хвороб, процеси старіння та відновлення, або регенерації. На сьогодні у науковій лабораторії ви можете знайти величезну колекцію найрізноманітніших ГМО: це і рослини, і дрозофіли, і миші, і кролі. Всі вони – величезні трудівники від науки. Й уявити собі сучасну науку без використання трансгенних тварин чи рослин просто неможливо. Мабуть, найпоширеніші ГМО – це організми, що експресують, або мають у своєму геномі ген зеленого фосфорилюючого білка медузи, так званий ген GFP. Такі тварини нічим не відрізняються від своїх диких родичів, і лише в ультрафіолеті ви можете побачити, що вони світяться примарним зеленим світлом, наче істоти з інших світів. Ця особливість є надзвичайно корисною для вивчення процесу та порядку ембріонального розвитку, метастазування ракових клітин тощо.

 

Яким чином створюють таких тварин? По-перше, вченому потрібно виділити ген, функцію якого він хоче дослідити в організмі або продукт якого треба напрацювати. Для створення тварин, які світяться в ультрафіолеті, спочатку виділили ген GFP із геному медузи, а пізніше – і з геному коралів. Однак отримати необхідний ген можна не лише із природного джерела (геному), а й з так званої геномної бібліотеки. Він може бути отриманий як хімічним (за наявності відповідної послідовності нуклеотидів), так і ферментативним (використання механізму зворотньої транскрипції) шляхами. На сьогоднішній день процес штучного (хімічного) синтезу генів є рутинною справою.

 

Мартін Чалфі, Сімомура Осаму та Роджер Цянь у 2008 році розділили Нобелівську премію з хімії за зелений флюоресцентний білок: відкриття, експресію та розробку.

 

Далі такий ген за допомогою природних механізмів клітини інтегрують, або вбудовують, у вектор. Вектор – це, частіше за все, бактеріальна плазмідна ДНК, головна функція якої у всьому цьому процесі – доставити чужорідний ген у ядро клітини організму, який зазнає модифікації. Техніка введення генів у бактерії була розроблена після того, як Фредерік Гріффіт відкрив явище бактеріальної трансформації. В основі цього явища лежить примітивний статевий процес, який у бактерій супроводжується обміном невеликими фрагментами нехромосомної ДНК (плазмідами). Плазмідні технології лягли в основу введення штучних генів в бактеріальні клітини і були б узагалі неможливими без знань і досягнень фундаментальної генетики та молекулярної генетики.

 

Щоб внесений ген постійно працював у кожній клітинці організму, який модифікується, краще за все вносити його у статеві клітини, тоді ген передається в усі клітини майбутньої тварини. За допомогою мікроін'єкції вектор із вбудованим геном вводять у пронуклеус сперматозоїда або яйцеклітини. Ця маніпуляція є «ювелірною» процедурою: виконується за допомогою мікроманіпулятора зі скляним капіляром діаметром близько 1 мкм. Увесь процес контролюється за допомогою мікроскопа; за одну маніпуляцію в статеву клітину вводиться близько 500—1000 копій «нового» гена. Після таких маніпуляцій отримують зиготу, яку підсаджують самицям (їх іще можна назвати сурогатними матерями). Нарешті, через 19,5-20 діб (якщо вчені працювали над мишами) народжується перше покоління модифікованих організмів – модифікованих мишей. Але це ще не кінець роботи! Вчені ще будуть аналізувати таких тварин, виявляти ті організми, де трансген вбудувався ефективно, схрещувати їх, аби вивести «чисту» лінію.

 

Як бачимо, це величезна робота, яка стала можливою завдяки відкриттям багатьох вчених. Для отримання лінії нових трансгенних мишей потрібно близько 1,5-2 років. На жаль, в Україні повний цикл створення таких тварин не проводиться через застарілу матеріально-технічну базу та брак коштів. (Однак я брала участь у створенні лінії модифікованих мишей; разом із колегами з Університу Пенсильванії (Філадельфія, США) ми намагались відтворити людський синдром Naxos. Це таке захворювання, яке спричиняється мутацією гена плакоглобіну і проявляється раптовими аритміями та може навіть закінчитися летально. Відтворення цього захворювання (так само, як і решти інших) в організмі миші є вкрай корисним для вивчення механізмів патології та розробки нових способів лікування.)

  

Увімкнути чи вимкнути?

 

Примусити чужий ген працювати у модифікованому організмі – це ще не найскладніше завдання! Усі ці технології та знання були використані для того, щоби примусити не працювати («мовчати») будь-який власний ген організму. Або ж навпаки: змусити його працювати удвічі активніше. В кінці 80-х років минулого сторіччя вперше з’явились «нокаутні» миші, які фактично зробили революцію в біології та медицині. Такі тварини створюються за тими ж принципами, що і ГМО, однак замість чужорідної ДНК використовується штучна (синтетична) копія невеликої ділянки власного гена, функцію якого планують дослідити. В таку копію спрямовано вносяться зміни (мутації), внаслідок яких цей ген або взагалі не працює, або ж навпаки – має підвищену активність.

 

Перші нокаутні миші були створені в 1987-1989 роках вченими Маріо Капеккі, Мартіном Евансом та Олівером Смітом. У 2007 році всі троє отримали Нобелівську премію в галузі медицини.

 

З тих пір, як ця методика була розроблена, її застосування дозволило створити тисячі різних ліній нокаутних мишей, кілька сотень з яких служать модельними об'єктами для вивчення людських хвороб. Уявіть лишень, що тепер вчені можуть відтворити в організмі миші чи щура фактично будь-яку хворобу людини: лейкемію, діабет, ожиріння, хворобу Альцгеймера чи Паркінсона!

 

А якщо знайдено новий ген, функція якого іще не вивчена? Не біда! Цитуючи доктора Річарда Войчіка із Jackson Laboratory (Бар Харбор, США), скажемо:  «Коли науковці відкривають новий ген людини, перше, про що варто подумати, – це нокаут цього гена в миші!». Так і є: нокаутні тварини дають змогу детально, на рівні всього організму, вивчити функцію будь-якого відомого чи невідомого нам гена! І навпаки: примусивши ген працювати активніше, ніж це потрібно організму за нормальних умов, можна викрити  механізми виникнення тих чи інших хвороб.

 

«Рocket-size humans»

 

Саме так жартома вчені називають лабораторних мишей. Чому? Тому що миші, як і ми з вами, також теплокровні, мають по суті таку ж будову тіла: голову, 4 кінцівки, 1 серце, 2 нирки. А головним є те, що геном миші, як і геном людини, повністю розшифрований, і він подібний до нашого на 95%. Саму тому на мишах відтворено вже більш ніж 500 хвороб людини, зроблено нокаут більш ніж 10 000 генів, а це становить приблизно половину всього геному людини! Як же це виглядає на практиці?

 

Двоє вчених із США – Дуглас Коулман та Джефрі Фрідман – у 2009 році отримали престижну премію The Shaw Prize в розмірі $1 млн за те, що зробили в мишах нокаут гена лептину. Лептин – це ген, що регулює в людей апетит та вагу; пригнічення його функції спричинює порушення апетиту та накопичення зайвої ваги. Саме таке відкриття зробили Коулман та Фрідман, а результати їхньої роботи не лише пояснили, як відбувається регуляція апетиту та виділення інсуліну, а й стали основою для лікування хворих на ожиріння, в геномі яких знайшли мутації гена лептину. Це лише один маленький, але дуже яскравий приклад!

 

У своїй лабораторії в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України, що знаходиться в Києві, ми використовуємо нокаутних тварин для того, щоб вивчати, як розвивається ембріональне серце, та як доросле серце пристосовується до навантажень. Застосовуючи цю технологію, ми зробили нокаут гена n-кадерину в ембріональному серці мишенят і виявили, що втрата цього гена лише у серці призводить до смерті ембріонів. А гинули вони через те, що їхне серце не розвивалось, не формувалась тканина майбутнього органу, бо були відсутні «контакти» між клітинами серця. Протягом останіх років ми вивчаємо, як нокаут іншого гена (b-катеніну) повпливає на пристосування серця до фізичних навантажень, стресів, процесу старіння. З часом результати нашої праці будуть використовуватися для діагностики та лікування хвороб серця у людей.

  

Кілька слів для естетів

 

Відверто кажучи, прикро, якщо в читача сформувалось уявлення, що ГМО, або трансгенні організми, застосовуються тільки для того, щоби врятувати нас від голоду, Або синтезувати нам цінні білки для ліків чи тваринництва. Є й інша галузь – естетична!

 

У 1999 році доктор Джуан Гонг із колегамии з Національного університету Сінгапуру працювали з відомим вже вам геном GFP. Вчені зробили вставку (ін'єкцію) гена GFP в ембріон акваріумної рибки Даніо, і саме вдала інтеграція гена медузи забезпечувала яскраву люмінісценцію рибок як під натуральним, так і під ультрафіолетовим світлом. Взагалі метою робочої групи доктора  Гонга було створення рибок, які могли б виконувати роль індикатора забруднення довкілля. Їхня ідея була простою: якщо рибка починає флюоресценцію, то це свідчить про присутність токсинів у навколишньому середовищі. Тож створення рибок із геном GFP було лише першим кроком у цьому процесі; потім робота була запатентована Національним університетом Сінгапуру. Незабаром команда Джуана Гонга отримала червоних флюоресцентних рибок Даніо з використанням гена морських коралів і помаранчево-жовтих Даніо  з мутованою формою гена GFP.

 

Пізніше компанія Yorktown Technologies уклала контракт з університетом і придбала цю технологію та авторські права на таких рибок Даніо, і нині вони продаються як звичайні акваріумні рибки. Компанія має власний сайт (http://www.glofish.com), де можна не лише помилуватись ними, а й легко знайти інформацію про їх утримання, а також наукові звіти про те, що ці Даніо нічим (окрім чарівного кольору) не відрізняються від звичайних родичів. Сто тисяч рибок, як повідомлено на ресурсі, розкуповуються менш ніж за місяць (по  $18,60 кожна). Тож Даніо стали першими ГМО-домашніми тваринами, а заразом і успішним бізнес-проектом!

 

«А якже мишки? А чи не шкода їх вам?»

 

Шкода! Саме тому робота із тваринами досить жорстко врегульована Законом «Про захист  тварин від жорстокого поводження», а також законодавством на рівні Євросоюзу. Окрім регулювання на державному рівні, ще й самі інститути слідкують за правами тварин. У нас в Інституті, до прикладу, є комісія з біоетики, яка контролює такі роботи.

 

Експериментальна робота з використанням тварин в усьому світі базується на правилі трьох R: це Reducing – Replacement – Refinement. Reducing – це зменшення кількості тварин у досліді до оптимально мінімальної, яка дасть змогу отримати достовірні й значимі результати. Тобто заборонено використовувати 100 мишей там, де можна обійтися, наприклад, 14-ма. З іншого боку, жодні вагомі результати через дослідження 1 або 3 мишей отримати неможливо.

 

Replacement: правило радить замінити використання вищих хребетних тварин (миші, щурі, собаки), якщо це можливо, на культуру клітин, нехребетних тварин (мушки дрозофіли, черви) або ж на нижчих хребетних тварин (рибки Даніо, тритони). Однак не завжди можна втілити правило в життя, бо деякі процеси (наприклад, розвиток пухлини чи формування та розвиток нервової системи, серця) просто немає змоги вивчати на рівні однієї ізольованої клітини або на організмах, які еволюційно стоять від людей досить далеко. Неможливо на таких організмах вивчати дію нових ліків або розробляти нові методи лікування хвороб людей. Refinement – це покращення умов утримання і зведення стресу тварин до мінімуму як під час їхнього утримання у віварії, так і під час проведення досліду.

 

Варто зауважити, що і за кордоном,  і в нас тварини живуть у спеціально облаштованих кімнатах, які звуться віваріями, або mouse house (animal facility). Там підтримується постійна температура, вологість, автоматично регулюється довжина світлового дня та ночі (цей фактор є надзвичайно важливим для розмноження та життєдіяльності гризунів). Тварини (в нашому випадку – миші та щурі) перебувають на повноцінному раціоні: вони отримують і комбікорм, і зерно, і овочі із фруктами, а також сир, яйця і м'ясо. Раз на тиждень у кімнатах робиться прибирання, а в клітках повністю міняють підстилку на чисту стерилізовану тирсу, також міняють воду. Ці тварини народжуються лише для виконання якогось запланованого та важливого дослідження, просто так вони не розмножуються: процес дуже чітко контролюється дослідниками, і кожна миша чи рибка має свій порядковий номер і генотип.

 

Тож коли ви приймаєте якісь ліки, просто згадайте цей текст і подякуйте не лише усім вченим, які брали участь у їх створенні (від ідеї та хімічної формули до дієвої форми у аптеці/лікарні), а й лабораторним тваринам. Саме використання лабораторних тварин дає змогу отримати максимально ефективні ліки з мінімальними побічними ефектами.

  

Справка:

 

Рекомбінація – процес, у якому ланцюжок ДНК розривається, а потім його фрагменти об'єднуються в іншому порядку.

Експресія гена – процес, при якому спадкова інформація генів (нуклеотидна послідовність) використовується для синтезу функціонального продукту: білка або РНК.

Метастазування – віддалене вторинне вогнище патологічного процесу, що викликане переміщенням (пухлинних клітин, мікроорганізмів) з первинного осередку хвороби через тканини організму

Нуклеотиди – це мономери нуклеїнових кислот. Нуклеїнові кислоти в еукаріотичних клітинах знаходяться в ядрі. Вони є у всіх живих організмів (у тих, у кого немає ядра, нуклеїнові кислоти все одно є — вони перебувають у центрі клітини у бактерій і утворюють нуклеоїд).

Зворотня транскрипція процес синтезу ДНК з використанням РНК як матриці.

Вектор транспортний засіб для передачі генетичного матеріалу у клітину. Вірусний вектор – вірус, який був змінений для трансдукції специфічного генетичного матеріалу у клітину, наприклад, для генетичної терапії. Плазмідний вектор також може використовуватися для доставлення штучного фрагменту рекомбінантної ДНК у складі плазміди до клітини, для чого застосовують різні методи трансфекції.

Пронуклеус (від лат. pro – перед і nucleus - ядро) – гаплоїдне ядро статевої клітини (гамети).

Зигота – клітина, що утворюється в результаті запліднення (злиття яйцеклітини і сперматозоїда).

Мутація зміни генетичного матеріалу (зазвичай ДНК або РНК).


comments powered by Disqus